前言
年10月欧易/鹿明生物合作客户山医院心病科杨传华教授课题组联合山东中医药大学第一临床医学院在JournalofEthnopharmacology期刊发表的题为“BanxiaBaizhuTianmadecoctionattenuatesobesity-relatedhypertension”的研究成果，通过LC-MS非靶向代谢组学研究方法，探索了BBTD对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的内皮保护作用，通过转录组测序，发现了BBTD在抗ox-LDL，保护血管内皮细胞的可能靶点。为治疗肥胖相关性高血压病症提供进一步的理论依据。
中文标题：半夏白术天麻汤减轻肥胖相关性高血压病症
研究对象：小鼠血浆
发表期刊：JournalofEthnopharmacology
影响因子：3.
发表时间：.10.8
合作单位：山东中医药大学临床医学院、山医院
运用生物技术：LC-MS非靶代谢组学(由鹿明生物提供技术支持)、转录组学
研究背景
经世界卫生组织（世卫组织）统计，年超过39%的人口超重（19亿），肥胖人口占比为13%（6.5亿）。身体质量指数（BMI）的增加与收缩压（SBP）和舒张压（DBP）有着密切的关系。据统计，高达78%的男性和64%的女性原发性高血压可归因于肥胖。肥胖和高血压的结合增加了动脉性高血压的患病风险，并且会导致心血管疾病（包括冠心病、充血性心力衰竭、心源性猝死、终末期肾病和中风）的发病率及死亡率的增加。血管结构和功能的改变被认为是肥胖相关性高血压的重要机制之一。内皮功能障碍和动脉硬化被认为是肥胖症血管功能障碍的最早表现，高血压发病前，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是高血压发生的重要危险因素。
虽然运动以及降低卡路里的摄入对降低高血压有效，但许多患者发现很难维持这一计划，故采取药物干预措施。半夏白术天麻汤（BBTD），是临床治疗高血压及高血压相关病症的常用中药方剂。根据中医理论和临床实践，BBTD特别适用于长期缺乏体力活动的高血压患者。
但是，BBTD对于改善症状效果的确切机制尚未完全阐明。这项研究根据非靶向代谢组学分析来评价BBTD对内皮细胞的保护作用。另外通过转录组测序，以研究BBTD在抗ox-LDL，保护血管内皮细胞的可能靶点。
研究思路
研究方法
1.实验材料：
作者将雄性小鼠随机分为高脂肪饮食（HFD组，n=41）和阴性对照（NC组，n=9）。选取体重大于NC组平均值的25%的27个HFD小鼠随机分为BBTD组、米沙坦组（Telmisartan）、模型组。
代谢组学所用实验材料为小鼠血浆。每组各7个生物学重复。
转录组测序所用实验材料为经BBTD（2mg/mL）/未经BBTD处理的ox-LDL（50μg/mL）诱导的HAECs。
多组学分析：LC-MS非靶向代谢组学+转录组测序
2.检测方法：
（1）生理生化实验：小鼠体重、SBP和DBP测定；
（2）功能验证实验：油红染色和HE染色观察主动脉形态，免疫荧光染色观察形态学变化，Westernblot检测蛋白表达量；
研究结果
1、BBTD可减轻体内与肥胖相关的高血压
通过八周的BBTD给药使肥胖相关性高血压小鼠的SBP和DBP分别降低12.1mmHg和10.5mmHg（P0.05）。BBTD和替米沙坦降低了小鼠的总胆固醇水平（P0.05，图1E）。油红O染色显示出模型小鼠动脉根部明显的脂质沉积，而BBTD减弱了油红O阳性范围（图1G）。HE染色证实了模型小鼠的血管平滑肌层增生和肥大，而BBTD改善了主动脉的形态（图1H）。
图1
半夏白竹天马汤（BBTD）可在体内减轻肥胖相关高血压
（A）具有代谢性的小鼠视觉外观图片
（B）体重(n=9)。（注:*P0.05，**P0.01）
（C）收缩压(n=9)。
（D）舒张压(n=9)。
（E）血浆总胆固醇(n=9)。
（F）血浆甘油三酯(n=9)。
（G）动脉根部油红染色的代表性图片。
（H）主动脉HE染色的代表性图片(x)。
2、BBTD调节小鼠血浆中的代谢产物
作者通过LC-MS非靶向代谢组学分析模型组和BBTD组小鼠血浆，共鉴定出94种差异代谢物。代谢组学结果显示，BBTD主要影响甘油磷脂（共24种:11种甘油乙醇胺、5种甘油磷酸酯、5种氧化甘油磷脂、2种甘油磷酸酯胆碱和1种甘油肌醇聚糖），其次是脂肪酰基(共10种)。KEGG富集显示（图2D）BBTD组小鼠受影响的主要途径为鞘磷脂信号通路、逆行性内源性大麻素信号通路、鞘磷脂代谢、液体剪切应力和动脉粥样硬化。其中，液体剪切应力和动脉粥样硬化与内皮功能障碍和肥胖相关高血压密切相关。
图2
半夏白竹天麻汤（BBTD）调节血浆代谢产物
（A）模型组和BBTD组PCA图（n=7）。
（B）模型组和BBTD组OPLS-DA图（n=7）。
（C）模型组和BBTD组聚类热图（n=7）。
（D）差异代谢物的KEGG代谢通路富集图。
3.BBTD对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的内皮保护作用
考虑到ox-LDL是导致内皮损伤的最重要因素之一，作者研究了BBTD对ox-LDL诱导的内皮细胞的影响。Ox-LDL使HAEC中的细胞凋亡率从4.4％增加到32.8％，达到7.4倍，而BBTD以剂量依赖性方式降低细胞凋亡率（图3A）。Ox-LDL显著抑制细胞迁移，诱导HAEC的细胞骨架萎缩。相反，BBTD则以剂量依赖性方式改善细胞迁移，说明BBTD处理有效地维持了细胞形态（图3B和3C）。另外，Ox-LDL诱导了VE-钙粘蛋白的浓缩密度，而BBTD降低了VE-钙粘蛋白的密度（图3D）。
图3
半夏白术天麻汤对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的内皮保护作用
经24小时的BBTD处理（2mg/mL）/未经BBTD处理的ox-LDL（50μg/mL）诱导的HAECs(n=3)。
（A）AnnexinV-FITC/PI双染色检测细胞凋亡率。
（B）采用Transwell小室进行细胞迁移研究。
（C）在激光共聚焦显微镜下用phalloidin染色观察细胞骨架。
（D）激光共聚焦显微镜下免疫荧光染色观察VE-钙粘蛋白的密度。
4.差异表达的mRNA
转录组测序结果显示，在ox-LDL组未处理的HAECs组中，ox-LDL诱导下HAECs中检测到个差异表达转录本。BBTD处理24小时后，BBTD处理组和ox-LDL组中共鉴定出个差异表达mRNA（个上调，个下调）（FC2，P0.05）。BBTD逆转了由ox-LDL诱导的mRNA（mRNA）中51.8％的变化（图4B）。Western印迹分析证实了BBTD降低了ANGPTL4，PLIN2的蛋白表达，增加了SLCO4C1的蛋白表达（图4C）。
通过DO富集分析（图4D）发现经BBTD处理的HAEC细胞中的差异转录本富集在动脉硬化、冠心病、高血糖和高血压中。GO分析（图4E）表明BBTD对有丝分裂、次生醇、甾醇，以及胆固醇的生物合成和代谢过程有调控作用。KEGG富集（图4F）表明类固醇生物合成，细胞周期，细胞粘附分子，甘油脂代谢，血管平滑肌收缩，p53信号通路和PPAR信号通路是显著富集到的通路。
图4
HAECs人主动脉内皮细胞（HAECs）的转录组测序
（A）BBTD与ox-LDL差异表达(DE)mRNA的热图。
（B）ox-LDL与未处理HAECs(蓝色)、BBTD与ox-LDL(*色)的差异mRNA维恩图。
（C）Westernblot检测ANGPTL4、PLIN2和SLCO4C1表达量。
（D）BBTD与ox-LDL差异表达(DE)mRNA的DO富集。
（E）BBTD与ox-LDL差异表达(DE)mRNA的GO富集。
(F)BBTD与ox-LDL差异表达(DE)mRNA的显著性富集pathway气泡图。
相关讨论
BBTD是临床治疗肥胖性高血压的常用中药方剂，但其药理机制仍不清楚。本实验旨在探讨BBTD对高脂饮食致肥胖性高血压小鼠的影响机制。研究表明，BBTD可有效降低肥胖相关性高血压小鼠的体重，SBP和DBP。在本研究中，BBTD的降压效果不如替米沙坦（降血压药物），但其减肥效果优于替米沙坦。BBTD能降低血浆总胆固醇水平，减轻动脉根的脂质沉积，缓解血管平滑肌细胞层增生肥厚并有助于提高动脉顺应性，从而降低血压。经BBTD处理后主动脉结构的改善可能是BBTD的重要药理机制之一。
基于代谢组学分析，BBTD主要影响甘油磷脂和脂酰基。生物信息学分析表明鞘脂代谢和液体剪切应力是动脉粥样硬化的主要途径。通过体外实验，表明BBTD具有内皮保护作用，可降低细胞凋亡率，并呈剂量依赖性改善细胞迁移，维持细胞形态。基于转录组测序分析，发现BBTD降低了ANGPTL4和PLIN2的蛋白表达，该结果表明BBTD可能通过调节脂质代谢来降低心血管疾病的风险。另一方面，BBTD增加了SLCO4C1蛋白的表达，表明其可能通过消除尿*症*素，减轻高血压和肾脏炎症从而降低肥胖和高血压的患病风险。
研究结论
在这项研究中，通过动物实验和细胞学研究，整合代谢组学和转录组学分析技术，探究BBTD对高脂饮食导致肥胖性高血压潜在的影响机制。该研究发现BBTD具有减轻肥胖相关性高血压的作用，并体现了中药方剂的多靶点效应。
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本研究首先根据非靶向代谢组学分析来评价BBTD对内皮细胞的保护作用。随后借助转录组测序，以研究BBTD在抗ox-LDL，保护血管内皮细胞的可能靶点。从而为解析BBTD减轻肥胖相关性高血压病症的作用机制提供进一步的理论依据。这项基于非靶代谢组学和转录组学的研究为探索中药方剂通过抑制ox-LDL刺激内皮细胞产生的损伤，达到保护心血管的作用机制提供了实用的研究策略。
参考文献：
1.Chaurasia,B.，etal..Adipocyteceramidesregulatesubcutaneousadiposebrowning,inflammation,andmetabolism.CellMetabol.24(6),–.
2.Iqbal,J.,Walsh,M.T.,Hammad,S.M.,Hussain,M.M.,.Sphingolipidsandlipoproteinsinhealthandmetabolicdisorders.TrendsEndocrinol.Metabol.28(7),–.
3.Kersten,S.,.Newinsightsintoangiopoietin-likeproteinsinlipidmetabolismandcardiovasculardiseaserisk.Curr.Opin.Lipidol.30(3),–.
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文章来源于鹿明生物